Секвенирование по Сэнгеру

8 (800) 201 83 46Россия, Казахстан, Беларусь

Бесплатная доставка

Из любого города России

30 рабочих дней

Срок исследования

Точность 99%

за 1 цикл «прочитывают» до 1000 пар нуклеотидов с высокой точностью

Строго конфиденциально

Все данные и результаты не могут быть переданы третьим лицам

←

→

Секвенирование

Молекула ДНК является носителем генетической информации практически во всех живых организмах. Она состоит из двух комплементарных, то есть соответствующих друг другу цепей нуклеотидов, формирующих уникальную последовательность.

Пару комплементарных нуклеотидов в составе цепи ДНК также называют парой оснований, сокращенно п.о.

Человеческий геном содержит около 3-х миллиардов пар оснований.

Секвенирование — метод, который используется в лабораторной практике для определения последовательности ДНК.

В диагностике его часто используют для поиска изменений в структуре генов или их регуляторных элементов, вызывающих заболевания (патогенные мутации, варианты).

Секвенирование по Сенгеру

Точность до 98%за один рабочий цикл можно «прочитывать» последовательности длиной до 1000 пар нуклеотидов с высокой точностью — до 98%

Секвенирование по Сэнгеру относится к классическим методам секвенирования. Метод был разработан в 1977 г. Фредериком Сэнгером и его коллегами. С его помощью в 1990-2003 г.г. в рамках проекта «Геном человека» был впервые полностью расшифрован человеческий геном.

Секвенирование по Сэнгеру и в настоящее время не теряет своей актуальности и является рутинным методом как в генетической диагностике, так и в научно-исследовательской практике. С его помощью за один рабочий цикл можно «прочитывать» последовательности длиной до 1000 пар нуклеотидов с высокой точностью — до 98%.

Сейчас метод секвенирования по Сэнгеру полностью автоматизирован. Автоматизация делает его надёжным и простым в исполнении, он является «золотым стандартом» современного секвенирования. С автоматизацией и увеличением производительности секвенаторов уменьшилась и стоимость данного метода.

Показания

для подтверждения данных, полученных методом NGS при выявлении патогенных вариантов или вариантов с неизвестной клинической значимостью.
для установления генетического статуса пациента в случае, когда у кого-либо из родственников уже была выявлена мутация и ее точное положение в геноме известно.

Из-за большого объема анализируемых последовательностей при использовании метода NGS некоторые участки могут быть прочтены неточно, поэтому в случае обнаружения находок методом NGS рекомендуется подтверждать их с помощью секвенирования по Сэнгеру.

Особенности метода

В основе метода секвенирования по Сэнгеру лежит использование дидезоксинуклеотидов, также известных как «терминирующие» нуклеотиды.

В пробирке проводят реакцию синтеза ДНК по уже существующей матрице (одноцепочечной генетической последовательности конкретного индивида), последовательность которой нужно установить.

Молекулу ДНК синтезирует фермент ДНК-полимераза, которая, в соответствии с матрицей, по одному встраивает нуклеотиды в растущую цепь.

Среди всех нуклеотидов имеется 1% «терминирующих», каждый из которых также несет особую флуоресцентную метку.

После встраивания таких нуклеотидов дальнейший синтез цепи становится невозможен. Ввиду того, что встраивание «терминирующего» меченного нуклеотида в растущую цепь ДНК — случайное событие, оно может с равной вероятностью произойти как в самом начале, так и после синтеза большей части комплементарной молекулы.

В результате образуется смесь уникальных фрагментов ДНК разной длины, которые начинаются одинаково, но заканчиваются в разных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы. Причём заканчиваются они одной из четырёх нуклеотидных меток.

Затем происходит разделение этих фрагментов по величине с помощью капиллярного электрофореза.

Синтезированные фрагменты ДНК разделяются под действием электрического поля: чем меньше фрагмент, тем он быстрее движется в геле.

Таким образом фрагменты «выстраиваются» в капилляре по длине.

После происходит детекция флуоресцентного нуклеотида на конце каждого фрагмента и определяется полная нуклеотидная последовательность исследуемого образца ДНК.

Сравнение методов

С момента изобретения секвенирования по Сэнгеру продолжались поиск и разработка альтернативных способов расшифровки ДНК. В последнее время большой популярностью пользуются методы секвенирования нового поколения (NGS). Однако, у каждой технологии есть свои особенности и выбор метода обычно производится исходя из поставленной задачи.

Метод секвенирования по Сэнгеру имеет ограничения

С его помощью можно прочитать только последовательности ДНК до 1000 пар оснований, полученные от одного человека, за один раз.

Кроме того, невозможно детектировать изменения в некоторой популяции клеток, когда в большей части образца представлена нормальная копия гена. Например, в опухолевых клетках происходят изменения, вызывающие их бесконтрольный рост. Такие изменения не будут присутствовать ни в каких других клетках организма.

Секвенирование по Сэнгеру позволяет детектировать изменения только если они проявляются не менее чем в 15-20% исследуемой ДНК.

15-20%исследуемого материала должно содержать изменения, чтобы их можно было детектировать методом Сенгера

Методы секвенирования нового поколения

Позволяют получить данные о более длинных последовательностях ДНК (вплоть до полногеномного секвенирования) и детектировать варианты (мутации), содержащиеся примерно в 5% исследуемой ДНК. Однако это происходит за счет одновременного прочтения большого числа коротких (в среднем, для методов, наиболее часто используемых в клинических лабораториях, 100-300 п.о.) последовательностей ДНК, которые затем соединяются и анализируются.

Процесс обработки таких данных достаточно трудоемкий и требует высокого уровня квалификации специалиста.

При этом точность интерпретации отдельных участков зависит от того, сколько раз этот участок был «прочитан».

В тех случаях, когда есть подозрения, что выявленный вариант является причиной заболевания, необходима 100% уверенность в правильном прочтении. Тогда имеет место подтверждение наличия патогенного или условно-патогенного варианта методом Сэнгера.

Также методы NGS являются дорогостоящими, из-за чего анализ с их помощью коротких последовательностей экономически невыгоден.

Поэтому, когда известны точные координаты предполагаемого изменения в геноме (например, если у кого-то из близких родственников был обнаружен патогенный или условно-патогенный вариант), проводить для него полноэкзомное секвенирование не обязательно. Можно просто секвенировать интересующий участок ДНК методом Сэнгера.

5%исследуемого материала должно содержать изменения, чтобы их можно было детектировать методом нового поколения (NGS)

Как заказать секвенирование по Сенгеру?

Позвоните 8 (800) 201-74-63 или оставьте заявку

Оплатите исследование на сайте

Стоимость 16 000 ₽

Сдайте венозную кровь

Необходимо сдать венозную кровь (4 мл.) в пробирки с ЭДТА (пробирка с фиолетовой крышкой) в любой лаборатории вашего города. Обязательно подпишите пробирки!

Позвоните курьеру 8 (800) 201-74-63

Курьер заберет набор с вашей кровью и бесплатно отвезет в лабораторию.