Мозаицизм

С появлением новых технологий для проведения ПГТ-А, таких как aCGH и NGS, стало возможным детектировать количество копий каждой хромосомы. Благодаря этому теперь есть возможность выявлять эмбриональный мозаицизм. Эмбриональный мозаицизм — это явление, характеризующееся наличием двух или более генетически различных клеточных линий (клонов клеток), обычно одна с хромосомной аномалией, а другая — с нормальным хромосомным набором.

Все клетки эмбриона происходят из одной оплодотворенной клетки-зиготы, но не все из них могут в дальнейшем иметь одинаковый набор хромосом.  Различия в хромосомном наборе среди клеток обусловлены митотическими ошибками (рис.1),

которые могут возникнуть в процессе развития эмбриона. В зависимости от того на каком этапе постзиготического развития эти ошибки возникли, мозаицизм может затрагивать разные части бластоцисты. 

Для исследования ПГТ-А проводят биопсию 5-10 клеток трофэктодермы на стадии бластоцисты, в то время как внутриклеточная масса (ВКМ) остается нетронутой. В некоторых случаях эмбрионального мозаицизма в процессе оценки конкретного биоптата могут возникнуть ошибки. Например, при биопсии эмбриона с мозаицизмом в клетках ВКМ, клетки трофэктодермы будут всегда отличаться, что приведет к неправильному результату. При биопсии эмбриона с мозаицизмом ВКМ/ТЭ — результат исследования будет отражать только статус трофэктодермы (эуплоид/анеуплоид), когда ВКМ будет содержать противоположный клон клеток (анеуплоид/эуплоид). 

Даже у эмбрионов с мозаичной трофэктодермой обнаружение мозаицизма будет зависеть от места биопсии в соответствии с различным распределением эуплоидных и анеуплоидных клеток. Поэтому при детекции мозаицизма в клетках трофэктодермы, процент мозаицизма в конкретной биопсии не может быть экстраполирован на весь эмбрион. Следовательно, результат, полученный при конкретной биопсии, следует рассматривать как относящуюся только к самой биопсии. 

На стадии бластоцисты было описано несколько видов мозаицизма клеток (рис. 2):

1. Полный мозаицизм — мозаицизм присутствует во внутриклеточной массе и в клетках трофэктодермы. 

2. Мозаицизм ВКМ — мозаицизм присутствует только во внутриклеточной массе. Такой мозаицизм невозможно детектировать.

3. Мозаицизм трофэктодермы (ТЭ) — мозаицизм присутствует только в клетках трофэктодермы.

4. Мозаицизм ВКМ/ТЭ (тип 1) — клетки трофэктодермы эуплоидные, а клетки ВКМ — анеуплоидные. Такой мозаицизм невозможно детектировать.

5. Мозаицизм ВКМ/ТЭ (тип 2) — клетки ВКМ эуплоидные, а клетки трофэктодермы — анеуплоидные. Такой мозаицизм невозможно детектировать.

Научные исследования показывают, что при проведении нескольких биопсий одного и того же эмбриона уровень конкордантности мозаицизма достигает 95-100 % (Johnson DS, Cinnioglu C, Ross R, Filby A, Gemelos G, Hill M, et al. Comprehensive analysis of karyotypic mosaicism between trophectoderm and innercell mass. Mol Hum Reprod, 2010).  Кроме того, исследователи также проанализировали ВКМ одних и тех же эмбрионов, чтобы оценить частоту несоответствий между клеточными линиями. TЭ и ВКМ при мозаицизме различаются всего лишь в 3–4% (Capalbo A, Wright G, Elliott T, Ubaldi FM, Rienzi L, Nagy ZP. FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage. Hum Repro, 2013).  Таким образом, биопсия трофэктодермы считается хорошим методом диагностики мозаицизма эмбриона.

Благодаря методу NGS появилась возможность более аккуратно детектировать мозаицизм в клетках трофэктодермы, что предоставляет возможность принять решение о переносе мозаичных эмбрионов при отсутствии эуплоидных. Следует отметить, что исследований, посвященных клиническим исходам после переноса мозаичных эмбрионов, мало.

Для того чтобы оценить реальную частоту и возможные последствия переноса мозаичного эмбриона, следует оценивать результаты ПГТ-А с учетом трех составляющих: качество эмбриона; количество проанализированных клеток; частота имплантации, выкидышей и живорождение для мозаицизма по данной конкретной хромосоме.

Не так давно было проведено исследование (Spinella, F, Fiorentino, F, Biricik, A, Bono, S, Ruberti, A, Cotroneo, E, Baldi, M, Cursio, E, Minasi MG, Greco E. Extent of chromosomal mosaicism influences the clinical outcome of in vitro fertilization treatments. Fertil Steril, 2018), в котором перенос мозаичных эмбрионов осуществляли пациентам, которые не смогли получить эуплоидные эмбрионы в программе ВРТ. Всего было проведено 77 эмбриотрансфера, из них 44 переноса — эмбрионы с процентом мозаицизма ниже 50%, 33 переноса – эмбрионы с процентом мозаицизма выше 50 %. Данные показывают, что практически половина (48.1%) переносов привела к биохимической беременности, 38.5% привело к имплантации, одна треть (30.8%) переносов мозаичных эмбрионов привело к живорождению. 

Однако, если сравнивать группы эуполидных и мозачных эмбрионов по исходам, данные исследования говорят о большем проценте имплантации (54.6% vs 38.5%), беременности (46.4% vs 30.0%) и живорождения (46.6% vs 30.8%) при переносе эуплоидных эмбрионов, в отличие от мозаичных, что вполне логично. Интересно, что при переносе эмбрионов с меньшим процентом мозаицизма (< 50%), такие показатели как биохимическая беременность, индекс имплантации и коэффициент живорождения были выше, чем в случае, чем с высоким процентом мозаицизма (> 50%),  что может говорить о том, что в ряде случаев низкоуровневый мозаицизм может быть вызван артефактами амплификации (см. «Технические особенности») . (Spinella, F, Fiorentino, F, Biricik, A, Bono, S, Ruberti, A, Cotroneo, E, Baldi, M, Cursio, E, Minasi MG, Greco E. Extent of chromosomal mosaicism influences the clinical outcome of in vitro fertilization treatments. Fertil Steril, 2018) 

В другом похожем исследовании (Victor, AR, Tyndall, JC, Brake, AJ, Lepkowsky, LT, Murphy AE, Griffin, DK, McCoy RC, Barnes, FL, Zouves, CG, Viotti, M. One hundred mosaic embryos transferred prospectively in a single clinic: exploring when and why they result in healthy pregnancies. Fertil Steril, 2019) было перенесено 100 мозаичных эмбрионов с различными хромосомными нарушениями: мозаичные моносомии/трисомии, сегментарные нарушения и мозаично-анеуплоидные эмбрионы (2 и более хромосом), процент анеуплоидных клеток составлял от 20 до 80%. Данные показали, что мозаичные эмбрионы с одиночными сегментарными нарушениями показали лучшие результаты в отношении достижения биохимической беременности (57.6% vs 49.0%) и имплантации (45.5% vs 38.0%), чем все остальные группы эмбрионов. Однако к переносу эмбрионов с мозаичными сегментарными нарушениями следует относиться с особой осторожностью ввиду более высокого риска врожденных пороков развития, ассоциированных с живорождением.

Уровень мозаицизма, полученный в ходе ПГТ-А конкретного биоптата как решающий критерий приоритетности переноса мозаичного эмбриона использовать всё-таки не рекомендовано. Важную роль играет характер хромосомного нарушения: полная хромосома или ее сегмент, а также то, какая хромосома была задействована.

Следует также отметить, что низкий или высокий процент мозаицизма в ходе ПГТ-А может быть следствием шумного профиля из-за различных технических причин, что может привести к ложным результатам (Preimplantation Genetic Diagnosis International Society. “PGDIS POSITION STATEMENT ON THE TRANSFER OF MOSAIC EMBRYOS IN PREIMPLANTATION GANETIC TESTING FOR ANEUPLOIDY (PGT-A).” PGDIS, 2019). Такие причины могут возникнуть на этапе биопсии трофэктодермы эмбриона: некачественная биопсия, при которой отбирается слишком мало клеток с повреждением или частичным разрушением и потерей клеточной ДНК, что влияет на профили хромосом. Также на этапе генетического анализа: при построении библиотеки низкое качество исходной ДНК (неравномерная амплификации всего генома) может привести к недостаточному или избыточному представлению хромосом (мозаицизм всей хромосомы) или хромосомных регионов (сегментарный мозаицизм). Алгоритмы биоинформатического анализа, используемые при нормализации бинов картирования хромосом, также могут потенциально изменять профили. В нашей лаборатории используется усовершенствованный биоинформатический алгоритм, кроме того, лаборатория отслеживает процент мозаичных эмбрионов как среди всех полученных  результатов, так и для конкретных эмбриологов. 

Пациенты, рассматривающие возможность переноса мозаичных эмбрионов, должны пройти генетическое консультирование, изучив возможные риски и исходы, связанные с переносом таких эмбрионов (8). На консультации пациенту должно быть разъяснено, что в случае достижения беременности при переносе мозаичного эмбриона, рекомендовано подтверждение кариотипа плода инвазивной пренатальной диагностикой, предпочтительно  с помощью амниоцентеза.

Международное общество преимплантационной генетической диагностики (PGDIS) опубликовало обновленные рекомендации для специалистов в 2019 году. Основные положения:

1. Специалистам (репродуктологам, эмбриологам, генетикам) следует информировать пациентов о том, что генетический тест, в данном случае ПГТ-А, основанный на отборе образца одной или небольшого количества клеток эмбриона, не может быть на 100% точным, учитывая технические и биологические факторы, включая мозаицизм хромосом.

2. При переносе мозаичных эмбрионов, пациентам необходимо разъяснить все потенциальные риски, о которых будет указано в форме информированного согласия.

3. Перенос эуплоидных эмбрионов должен быть приоритетным в сравнении с переносом мозаичных эмбрионов. 

4. В случае рассмотрения возможности переноса мозаичного эмбриона следует обсудить следующие варианты с пациентом:

1. инициирование следующего цикла ЭКО с ПГТ-А для увеличения вероятности получения эуплоидного эмбриона для переноса;
2. Перенос бластоцисты с мозаицизмом более низкого уровня после соответствующей консультации.

Специалистам следует настоятельно рекомендовать пациентам пренатальную диагностику плода и плаценты любой установленной беременности после ПГТ-А, особенно после переноса мозаичного эмбриона. Анализ в ходе амниоцентеза (с 14 недели) в настоящее время считается наиболее репрезентативным для изучения хромосомного статуса плода. Из более ранних исследований (с 10 недели) можно также рассмотреть НИПТ, который анализирует количество копий всех 24 хромосом у плода — стандартные 5-хромосомные тесты НИПТ для хромосом 21, 18, 13 X и Y могут не подходить. Также должно быть использовано ультразвуковое исследование для выявления аномалий плода, в то время как скрининг PAPP-A и ультразвуковая допплерография также могут быть использованы для выявления нарушений функции плаценты.

1. Capalbo A, Wright G, Elliott T, Ubaldi FM, Rienzi L, Nagy ZP. FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage. Hum Reprod 2013; 28.

2. Johnson DS, Cinnioglu C, Ross R, Filby A, Gemelos G, Hill M, et al. Comprehensive analysis of karyotypic mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Mol Hum Reprod 2010; 16:944–9.

3. Martinez MC, Mendez C, Ferro J, Nicolas M, Serra V, Landeras J. Cytogenetic analysis of early nonviable pregnancies after assisted reproduction treatment. Fertil Steril 2010; 93:289–92.

4. Hassold T. Mosaic trisomies in human spontaneous abortions. Hum Genet 1982; 61:31–5.

5. Maria Vera-Rodriguez, Ph.D. and Carmen Rubio, Ph.D. Assessing the true incidence of mosaicism in preimplantation embryos . Fertil Steril, 2017; 107, 5, 0015-0282

6. Besser AG, Mounts EL. Counselling considerations for chromosomal mosaicism detected by preimplantation genetic screening. Reprod Biomed Online 2017; 34:369–74.

7. Francesca Spinella, Ph.D., Francesco Fiorentino, Ph.D., Anil Biricik, Ph.D., Sara Bono, Ph.D.,Alessandra Ruberti, B.Sc., Ettore Cotroneo, Ph.D., Marina Baldi, Ph.D., Elisabetta Cursio, B.Sc., Maria Giulia Minasi, B.Sc., and Ermanno Greco, M.D. Extent of chromosomal mosaicism influences the clinical outcome of in vitro fertilization treatments. Fertil Steril, 2017, 0015-0282.

8. Preimplantation Genetic Diagnosis International Society. “PGDIS POSITION STATEMENT ON THE TRANSFER OF MOSAIC EMBRYOS IN PREIMPLANTATION GANETIC TESTING FOR ANEUPLOIDY (PGT-A).” PGDIS, 27, May 2019